In der molekularpathologischen Diagnostik wird häufig die amplikonbasierte Parallelsequenzierung eingesetzt. Durch diese Methodik können therapierelevante Gene und Genabschnitte mittels Multiplex-PCR amplifiziert, angereichert und im Anschluss sequenziert werden. Dieses Verfahren kann auch bei der fragmentierten und chemisch modifizierten DNA aus formalinfixiertem, und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebe eingesetzt werden.
Eine Alternative ist die „Hybrid Capture“ basierte Parallelsequenzierung für den simultanen Nachweis von somatischen Genmutationen, Genfusionen und Kopienzahlveränderungen. Dabei wird die DNA zunächst fragmentiert und an Adapter ligiert. Anschließend werden kundenspezifische Sonden an die Fragmente der Zielregionen hybridisiert. Diese Sonden sind mit Biotin markiert. Durch Einsatz von Streptavidin Beads werden die spezifischen Hybride und damit die gewünschten Zielfragmente des humanen Genoms angereichert. Anschließend werden fertige Bibliotheken auf dem NextSeq 500 von Illumina sequenziert.
Zusätzlich sind auch auf Ebene der RNA bereits kommerzielle RNA-basierte Parallelsequenzierungsansätze für den Nachweis von Genfusionen entwickelt worden. Hierbei werden spezifische Primer für den Nachweis bekannter Fusionen verwendet und anhand eine 5´/3´ Imbalance können bisher unbekannte Fusionen detektiert werden. Unter Verwendung von RNA-basierten Assays können zudem auch mehrere Fusionsereignisse in einem Assay nachgewiesen werden.
In zwei translationalen Projekten in Zusammenarbeit mit klinischen Kollegen werden jeweils zwei kundenspezifische Parallelsequenzierungsansätze für die Analyse von Lymphomen und pädiatrischen Tumoren an FFPE Material etabliert. Auf Ebene der DNA wird eine „Hybrid Capture“ basierte Parallelsequenzierung für den simultanen Nachweis von somatischen Genmutationen und Kopienzahlveränderungen entwickelt und auf Ebene der RNA wird eine „Single Primer Extension“ basierte Parallelsequenzierung für den Nachweis von Fusionen etabliert. Neben der Anwendung für Forschungsfragestellungen im Bereich der zielgerichteten Therapien für Lymphome und pädiatrische Tumore, sollen diese neuen Assays nach Evaluierung in die molekularpathologische Routinediagnostik überführt werden für eine umfangreichere zielgerichtete Diagnostik und Therapiemöglichkeit.
Die Kooperation der Ruhr Universität Bochum mit dem Lungenkrebszentrum Bonn/Rhein‐Sieg und dem Kölner Institut für Pathologie hat einen Folgeantrag zum Vorhaben FP 339 „Entwicklung proteinanalytischer Verfahren zur Identifikation von Kandidatenmarkern zur Unterstützung der (Früh‐)Diagnose asbestassoziierter Lungen‐ und Pleuratumoren“ erfolgreich beantragt. Das Projekt fokussiert sich auf den Ausbau und die Verifizierung der zahlreichen Ergebnisse, die im initialen Vorhaben erzielt wurden. Darüber hinaus wird eine für die mechanistische Verifizierung notwendige Erweiterung auf den Ebenen der Genomik und der Transkriptomik hinzugefügt. Das Institut für Pathologie verfügt diesbezüglich über eine langjährige Expertise bei der Analyse von genomischen Veränderungen in Lungentumoren. Von den erzielten Ergebnissen können zukünftig nicht nur Personen aus der Allgemeinbevölkerung, sondern vor allem auch Beschäftigte im Rahmen der nachgehenden Vorsorge profitieren, wenn es gelingt, Früherkennungsmarker zu etablieren, die Lungentumore zuverlässig in einem therapierbaren Stadium diagnostizieren können. Bis zum 31.10.2019 wurden im Rahmen dieses Projektes Material von 153 Studienteilnehmern fixiert, geschnitten, beurteilt und nach Bochum zurückgegeben. Davon sind 69,5% primäre Lungentumoren und 11% Metastasen aus anderen Entitäten, das entspricht 124 Fällen. Für 19,5 % der Fälle wurden nicht maligne Tumoren diagnostiziert, die als Kontrollgewebe verwendet werden. Neben der Etablierung von Biomarkern zur Früherkennung kann durch die im Projekt zu erwartenden mechanistischen Erkenntnisse zum Krebsentstehungsprozess eine Grundlage für eine personalisierte Krebstherapie gelegt und somit auch ein Nutzen für die Tertiärprävention erzielt werden. Ein langfristiges Ziel ist hier auch die Implementierung der Blutprobendiagnostik für die personalisierte Krebstherapie bei Lungentumoren. Im Rahmen des Projektes wurde von jedem der 153 Studienteilnehmer zusätzlich eine korrespondierende Plasmaprobe gewonnen. Davon konnten bis zum 31.10.2019 55 Proben mittels Parallelsequenzierung analysiert werden. Hierbei ist vor allem entscheidend, ob sich genomische Veränderungen im Krebsgewebe bei frühen, noch kurativ resektablen Lungentumoren bereits im Plasma detektieren lassen. Falls diese Frage positiv beantwortet werden kann, besteht die Möglichkeit, die Spezifität der Krebsfrühdiagnostik von verdächtigen Lungenherden, die im CT‐Screening detektiert werden, wesentlich zu verbessern und diese Methodik im Rahmen der Überwachung von Risikopersonen einzusetzen.
Das Oesophaguskarzinom (EAC) zählt zu den Tumorentitäten mit einer Überlebensrate von unter 20%. Neue Therapiemöglichkeiten, wie z.B. Immuntherapien, könnten das Ansprechen und Überleben deutlich verbessern. Bisher gibt es jedoch keinerlei Charakterisierung des Immunprofils von EAC, welches therapierelevanter Checkpoints, prognostische Cancer Testis Antigene (CTA) oder Inflammationsmarker umfasst. Des Weiteren ist es von Interesse, ob eine vorherige neoadjuvante Chemotherapie (NACT) den Immunstatus bezüglich einer möglichen Zweitlinientherapie mit Immuncheckpointinhibitoren negativ beeinflusst. RNA aus FFPE Tumor- und Normalgewebe behandlungsnaiver (n=29) und post-NACT Patienten (n=17) wurde mittels Genexpressionsassay (PanCancer Immuneprofile Panel, NanoString) auf 770 immunrelevante Marker untersucht. Hierbei zeigten 22 Gene eine signifikant (p <0,05) erhöhte Genexpression (Fold Change> 2) und 14 Gene eine verminderte Genexpression. Die meisten der signifikant veränderten Gene sind an der Regulation von Immunantworten, T- und B-Zellfunktionen sowie der Antigenpräsentation beteiligt (CD3, CD8, MHC-I). Die Bestimmung der Inflammationssignatur (TIS) um das Ansprechen auf eine mögliche PD-L1-Blockade vorherzusagen zu können, zeigte eine numerisch höhere TIS- und HLA-Expression als post-NACT EAC. Auch im Tumormikromillieu (TME) war der Immun-Checkpoint-Rezeptor CTLA-4 in der EAC signifikant hochreguliert, die PD-1-Expression zeigte eine 2-3fach erhöhte Expression, während die Expression von PD-L1 mit normalem Gewebe vergleichbar war. Die immunmodulierenden Moleküle ARG1 und IDO1 des Tumormikromilieus zeigten eine signifikant unterschiedliche Expression in EAC gegenüber normalem Gewebe sowie gegenüber der NACT-Gruppe. Als prominenteste Chemokinrezeptorachse in naiven EAC wurde die CXCL9-, -10, -11 / CXCR3-Achse gefunden, die mit Proliferation und Metastasenbildung von Krebszellen assoziiert ist. Primäre EAC zeigen ein Immunprofil, welches sie für eine mögliche Immuntherapie prädestinieren. Desweiteren zeigte sich eine negative Beeinflussung des lokalen Immunstatus durch vorherige NACT, wodurch eine Kombination aus Immuntherapie und NACT nur eingeschränkt empfehlenswert wäre.
Cancer Immunol Immunother. 2020 Jan 20. doi: 10.1007/s00262-019-02475-w.
In gesunden Zellen besteht eine Balance aus Histonacetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs). Histonmodifikationen sind ein essentieller Bestandteil der epigenetischen Regulation und eine Deregulation dieser Balance führt zur Entstehung und Progression von vielen Erkrankungen, inklusive Tumoren. Daher sind HDACs vielversprechende neue Angriffspunkte für eine zielgerichtete Therapie.
HR23b wurde als ein potentieller Biomarker für die Sensitivität gegenüber HDACi in kutanen T‑Zell Lymphomen und hepatozellulären Karzinomen beschrieben. Ziel unserer Forschungsarbeit ist es, HR23b als potentiellen prädiktiven Biomarker für eine HDACi basierte Therapie in soliden Tumoren (Sarkome und gastrointestinale Stromatumore, Melanome und Adenokarzinome der Lunge) zu untersuchen.
Die Grundvoraussetzung für den Einsatz dieses Proteins als prädiktiven Biomarker ist seine Expression. Unsere bisherigen Forschungsarbeiten zeigten, dass ausgewählte Sarkom- und GIST-Zelllinien ein breites Spektrum an HR23b Expression aufwiesen (Westernblot-Analysen). Die HDACi Behandlung mit Vorinostat, Belinostat, Mocetinostat und Entinostat zeigte in Sarkomen antiproliferative und proapoptotische Effekte. Die Korrelation der HR23b Expression und der Sensitivität gegenüber HDACi zeigte weiterhin, dass HR23b ein potentieller neuer Biomarker für das Ansprechen von Vorinostat in Sarkomen darstellen könnte, da eine signifikante Korrelation beobachtet werden konnte. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die HR23b Expression konzentrationsabhängig unter HDACi reduziert wird. In einem Kollektiv aus über 500 klinischen Sarkom- und GIST-Proben konnte weiterhin gezeigt werden, dass 12,5% der Sarkome und 23,2% der GISTs stark positiv für HR23b sind. Vor allem stark aggressive Entitäten wie maligne periphere Nervenscheidewandtumore, Leiomyosarkome und Angiosarkome zeigten eine hohe HR23b Positivität, die sie zu potentiellen neuen Kandidaten für weitere Studien mit HDACi basierter Therapie machen. (Ihle et al., JCP, 2015).
Um diese Beobachtungen auf andere solide Tumore zu erweitern, soll die Expression und Funktion von HR23b auch in Melanomen und Adenokarzinomen der Lunge untersucht werden. Humane Zelllinien dieser Tumorentitäten werden in vitro auf ihre Sensitivität gegenüber HDACi in Korrelation mit der HR23b Expression untersucht. Weiterhin soll in allen untersuchten Tumorentitäten die Expression der einzelnen HDACs immunhistochemisch analysiert und diese mit der Sensitivität gegenüber HDACi korreliert werden.
Ein stabiler knock-down der HR23b Expression mittels CRISPR/Cas soll Aufschluss über die zelluläre Funktion von HR23b geben. Hierbei wird vor allem die Sensitivität gegenüber HDACi, die Viabilität, die Apoptose und die Signaltransduktion untersucht. Hier konnten wir bereits zeigen, dass eine HR23b –abhängige Apoptoseinduktion via Death-Receptor Signalwege stattfindet. Im Gegensatz hierzu zeigt sich, dass ein Verlust an HR23b Expression den Antwortmechanismus auf eine HDACi-Therapie in Richtung Autophagie anstatt Apoptose verschiebt. Desweiteren haben wir eine prominente Hochregulation verschiedener Immuntherapie Zielgene/-proteine entdecken können.
Schlussfolgerung: Das Verständnis der Hauptsignalwege, über welche die Antwort auf HDAC Inhibitoren reguliert wird, spielt eine große Rolle für zukünftige Therapieansätze. Hier soll vor allem der mögliche Biomarker HR23b eine Patientenstratifizierung ermöglichen. Als weiteren, wichtigen Aspekt konnten wir eine Hochregulation der endogenen antitumor Aktivität sowie verschiedener Immuntherapie Targets zeigen, welche eine mögliche Kombination aus HDAC Inhibitoren und Immuntherapie rationalisiert.
Die Kooperation der Ruhr Universität Bochum mit dem Lungenkrebszentrum Bonn/Rhein‐Sieg und dem Kölner Institut für Pathologie hat einen Folgeantrag zum Vorhaben FP 339 „Entwicklung proteinanalytischer Verfahren zur Identifikation von Kandidatenmarkern zur Unterstützung der (Früh‐)Diagnose asbestassoziierter Lungen‐ und Pleuratumoren“ erfolgreich beantragt. Das Projekt fokussiert sich auf den Ausbau und die Verifizierung der zahlreichen Ergebnisse, die im initialen Vorhaben erzielt wurden. Darüber hinaus wird eine für die mechanistische Verifizierung notwendige Erweiterung auf den Ebenen der Genomik und der Transkriptomik hinzugefügt. Das Institut für Pathologie verfügt diesbezüglich über eine langjährige Expertise bei der Analyse von genomischen Veränderungen in Lungentumoren. Von den erzielten Ergebnissen können zukünftig nicht nur Personen aus der Allgemeinbevölkerung, sondern vor allem auch Beschäftigte im Rahmen der nachgehenden Vorsorge profitieren, wenn es gelingt, Früherkennungsmarker zu etablieren, die Lungentumore zuverlässig in einem therapierbaren Stadium diagnostizieren können. Es sollen Gewebe von 150 operablen Lungenkarzinomen pro Jahr kryoasserviert und Vollblut-, Plasma- sowie Speichelproben von denselben Patienten gewonnen werden. Bei den OP-Präparaten soll auch tumorfreies Randgewebe berücksichtigt werden. Weiterhin können von 50 weiteren Patienten Lymphknoten-Biopsien gewonnen werden. Neben der Etablierung von Biomarkern zur Früherkennung kann durch die im Projekt zu erwartenden mechanistischen Erkenntnisse zum Krebsentstehungsprozess eine Grundlage für eine personalisierte Krebstherapie gelegt und somit auch ein Nutzen für die Tertiärprävention erzielt werden. Ein langfristiges Ziel ist hier auch die Implementierung der Blutprobendiagnostik für die personalisierte Krebstherapie bei Lungentumoren. Hierbei ist vor allem entscheidend, ob sich genomische Veränderungen im Krebsgewebe bei frühen, noch kurativ resektablen Lungentumoren bereits im Plasma detektieren lassen. Falls diese Frage positiv beantwortet werden kann, besteht die Möglichkeit, die Spezifität der Krebsfrühdiagnostik von verdächtigen Lungenherden, die im CT‐Screening detektiert werden, wesentlich zu verbessern und diese Methodik im Rahmen der Überwachung von Risikopersonen einzusetzen.
