Translationale Pathologie - AG Merkelbach-Bruse

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Translationale Diagnostik

Neue Strategien in der Parallelsequenzierung – Alternative Anreichungstechnologien und RNA-Sequenzierung

In der molekularpathologischen Diagnostik wird bislang zumeist die amplikonbasierte Parallelsequenzierung eingesetzt. Durch diese Methodik können therapierelevante Gene und Genabschnitte mittels Multiplex-PCR amplifiziert, angereichert und im Anschluss sequenziert werden. Dieses Verfahren kann auch bei der fragmentierten und chemisch modifizierten DNA aus formalinfixiertem, und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebe eingesetzt werden.

Der Nachteil der amplikonbasierten Parallelsequenzierung ist, dass chromosomale Aberrationen wie Genfusionen und -translokationen mit dieser Anreichungsmethode auf Ebene der DNA nicht detektiert werden können. Diese Veränderungen werden bislang in der Routinediagnostik mittels FISH und RT-PCR oder Immunhistochemie nachgewiesen. Der Hauptnachteil dieser Methoden ist, dass für jede einzelne chromosomale Aberrationen ein spezifischer Assay durchgeführt werden muss. Dadurch sind sie zeitaufwendig, es wird viel Ausgangsmaterial benötig und insbesondere die FISH ist sehr kostenintensiv. Die Weiterentwicklung der Parallelsequenzierung zur Erfassung aller therapeutisch relevanten genomischen Veränderungen in einem einzigen Assay ist ein fortlaufender Prozess. Gegenwärtig werden verschiedene Technologien unter Verwendung von extrahierter Nukleinsäure (DNA oder RNA) zum Nachweis chromosomaler Aberrationen getestet.

Auf Ebene der DNA wird die „Hybrid Capture“ basierte Parallelsequenzierung für den simultanen Nachweis von somatischen Genmutationen, Genfusionen und Kopienzahlveränderungen ausgetestet. Dabei wird die DNA zunächst fragmentiert und an Adapter ligiert. Anschließend werden kundenspezifische Sonden an die Fragmente der Zielregionen hybridisiert. Diese Sonden sind mit Biotin markiert. Durch Einsatz von Streptavidin Beads werden die spezifischen Hybride und damit die gewünschten Zielfragmente des humanen Genoms angereichert. Anschließend werden fertige Bibliotheken auf dem NextSeq 500 von Illumina sequenziert.

Auf Ebene der RNA sind bereits kommerziell RNA-basierte Parallelsequenzierungsansätze für den Nachweis von Genfusionen entwickelt worden. Hierbei werden spezifische Primer für den Nachweis bekannter Fusionen verwendet und anhand eine 5´/3´ Imbalance können bisher unbekannte Fusionen detektiert werden. Unter Verwendung von RNA-basierten Assays können zudem auch mehrere Fusionsereignisse in einem Assay nachgewiesen werden. Es ist jedoch nicht eindeutig, ob somatische Genmutationen, wie Punktmutationen, kleine Deletionen, Insertionen oder Duplikationen, mit diesem Ansatz zuverlässig detektiert werden können. Für den Nachweis von somatischen Genmutationen muss zur Zeit ein zusätzlicher DNA-basierter Assay verwendet werden. Darüber stellt die Extraktion von intakter RNA aus FFPE-Material eine große Herausforderung dar.

Das Ziel dieser Arbeiten ist es, die neuen Strategien der Parallelsequenzierung für die molekularpathologische Routinediagnostik zu evaluieren und zu vergleichen und die geeignetsten Methoden in die Routinediagnostik zu überführen.

Etablierung neuer Sequenzierungstechnologien zur Detektion chromosomaler Aberrationen und Genmutationen in Sarkomen - Köln Fortune Projekt

In diesem Forschungsprojekt wird eine neue Hybridisierungs-basierte Sequenzierungstechnologie zur Detektion genomischer Aberrationen in Sarkomen an FFPE Material etabliert. Neben der Anwendung für Forschungsfragestellungen im Bereich der zielgerichteten Therapien soll dieser neue Assay in die molekularpathologische Routinediagnostik eingeführt werden, um u. a. die Etablierung  zielgerichteter Therapiestrategien innerhalb der Universitätskliniken im Bereich der Sarkome voranzutreiben. Unser langfristiges Ziel ist es zudem, die Infrastruktur für die molekular zielgerichteten Therapien in der klinischen Onkologie zu verstärken. Durch die Veröffentlichung der Technologie in einem peer-reviewed Journal soll das Sarkompanel und die gesammelten Erfahrungen für weitere molekularpathologische Einrichtungen zugänglich gemacht werden.

nanoString nCounter Technologie in der molekularpathologischen Diagnostik und Forschung

Die nCounter Analysetechnologie der Firma NanoString beruht auf der Markierung  spezifischer Zielregionen mittels farbkodierter Hybridisierungssonden. Daraus ergeben sich vielfältige Anwendungsmöglichkeiten, wie z.B. 1) Genexpressionsanalysen, 2) SNV Bestimmung und 3) Detektionen von chromosomalen Fusionen. Die Analyse wird an RNA durchgeführt, welche aus Frischgewebe, Zelllysat oder FFPE-fixierten Tumorgewebe extrahiert wurde. Zur Detektion von Fusionsgenen in Lungentumoren steht ein spezielles Panel zu Verfügung, welches chromosomale Aberrationen in den Genen ALK-, RET-, ROS-1 und NTRK1, -2, -3 detektieren kann. Zum einen können spezifische Fusionsevents und deren zugehörige Translokationspartner identifiziert werden (spezifische Sonden). Zum anderen ist die Detektion von Fusionen mit unbekanntem Translokationspartner möglich (5´-3´ Imbalance Sonden).

(Lungen-) Fusions Panel
Spezifische Lungen Genfusionssonden detektieren die folgenden Fusionen:

ALKRETROS1NTRK1
EML4-ALKCCDC6-RETCD74-ROS1CD74-NTRK1
HIP1-ALKKIF5B-RETEZR-ROS1MPRIP-NTRK1
KIF5B-ALKGOPC-ROS1
TFG-ALKLRIG3-ROS1
TPR-ALKSDC4-ROS1
SLC34A2-ROS1
TPM-ROS1

Zusätzliche 5´/3´ Expressions Imbalance Sonden detektieren Fusionsevents mit unbekanntem Translokationspartner:

ALKRETROS1NTRK1NTRK2NTRK3
8 imbalanced probes 8 imbalanced probes 8 imbalanced probes 8 imbalanced probes 8 imbalanced probes 8 imbalanced probes

ProSigna

Die Therapie von Patientinnen mit Brustkrebs in einem frühen Stadium beginnt mit der genauen Einschätzung des Rezidivrisikos. Der Prosigna Assay wurde auf Basis der PAM50-Gensignatur entwickelt und ermöglicht die Einteilung von Tumoren in verschiedene intrinsische Subtypen, welche sich biologisch und klinisch unterscheiden. Zusätzlich ermittelt der Test einen Proliferationswert, d.h. die Expression verschiedener Gene innerhalb des Proliferationssignalwegs. In Kombination mit klinischen Daten zu Tumorgröße und Anzahl der positiven Lymphknoten ergeben sich daraus prognostische Informationen zur Therapieentscheidung. Der Risk-Of-Recurrence Score (ROR-Score) wird auf einer Skala von 0-100 angegeben und hat sich über die Dauer der endokrinen Behandlung von 5 Jahren hinaus als prognostisch signifikant erwiesen. Detaillierte Informationen zum Hintergrund des Tests und zur Kostenerstattung finden sie auf der Homepage des Herstellers.

Entwicklung proteinanalytischer Verfahren zur Identifikation von Kandidatenmarkern zur Unterstützung der (Früh‐)Diagnose asbestassoziierter Lungen‐ und Pleuratumoren

Die Kooperation der Ruhr Universität Bochum mit dem Lungenkrebszentrum Bonn/Rhein‐Sieg und dem Kölner Institut für Pathologie hat einen Folgeantrag zum Vorhaben FP 339 „Entwicklung proteinanalytischer Verfahren zur Identifikation von Kandidatenmarkern zur Unterstützung der (Früh‐)Diagnose asbestassoziierter Lungen‐ und Pleuratumoren“ erfolgreich beantragt. Das Projekt fokussiert sich auf den Ausbau und die Verifizierung der zahlreichen Ergebnisse, die im initialen Vorhaben erzielt wurden. Darüber hinaus wird eine für die mechanistische Verifizierung notwendige Erweiterung auf den Ebenen der Genomik und der Transkriptomik hinzugefügt. Das Institut für Pathologie verfügt diesbezüglich über eine langjährige Expertise bei der Analyse von genomischen Veränderungen in Lungentumoren. Von den erzielten Ergebnissen können zukünftig nicht nur Personen aus der Allgemeinbevölkerung, sondern vor allem auch Beschäftigte im Rahmen der nachgehenden Vorsorge profitieren, wenn es gelingt, Früherkennungsmarker zu etablieren, die Lungentumore zuverlässig in einem therapierbaren Stadium diagnostizieren können. Es sollen Gewebe von 150 operablen Lungenkarzinomen pro Jahr kryoasserviert und Vollblut-, Plasma- sowie Speichelproben von denselben Patienten gewonnen werden. Bei den OP-Präparaten soll auch tumorfreies Randgewebe berücksichtigt werden. Weiterhin können von 50 weiteren Patienten Lymphknoten-Biopsien gewonnen werden. Neben der Etablierung von Biomarkern zur Früherkennung kann durch die im Projekt zu erwartenden mechanistischen Erkenntnisse zum Krebsentstehungsprozess eine Grundlage für eine personalisierte Krebstherapie gelegt und somit auch ein Nutzen für die Tertiärprävention erzielt werden. Ein langfristiges Ziel ist hier auch die Implementierung der Blutprobendiagnostik für die personalisierte Krebstherapie bei Lungentumoren. Hierbei ist vor allem entscheidend, ob sich genomische Veränderungen im Krebsgewebe bei frühen, noch kurativ resektablen Lungentumoren bereits im Plasma detektieren lassen. Falls diese Frage positiv beantwortet werden kann, besteht die Möglichkeit, die Spezifität der Krebsfrühdiagnostik von verdächtigen Lungenherden, die im CT‐Screening detektiert werden, wesentlich zu verbessern und diese Methodik im Rahmen der Überwachung von Risikopersonen einzusetzen.

Biomarker Research

HR23b als prädiktiver Biomarker für die Histondeacetylase-Inhibitor basierte Therapie in soliden Tumoren

In gesunden Zellen besteht eine Balance aus Histonacetyltransferasen (HATs) und Histondeacetylasen (HDACs). Histonmodifikationen sind ein essentieller Bestandteil der epigenetischen Regulation und eine Deregulation dieser Balance führt zur Entstehung und Progression von vielen Erkrankungen, inklusive Tumoren. Daher sind HDACs vielversprechende neue Angriffspunkte für eine zielgerichtete Therapie.
HR23b wurde als ein potentieller Biomarker für die Sensitivität gegenüber HDACi in kutanen T‑Zell Lymphomen und hepatozellulären Karzinomen beschrieben. Ziel unserer Forschungsarbeit ist es, HR23b als potentiellen prädiktiven Biomarker für eine HDACi basierte Therapie in soliden Tumoren (Sarkome und gastrointestinale Stromatumore, Melanome und Adenokarzinome der Lunge) zu untersuchen.

Die Grundvoraussetzung für den Einsatz dieses Proteins als prädiktiven Biomarker ist seine Expression. Unsere bisherigen Forschungsarbeiten zeigten, dass ausgewählte Sarkom- und GIST-Zelllinien ein breites Spektrum an HR23b Expression aufwiesen (Westernblot-Analysen). Die HDACi Behandlung mit Vorinostat, Belinostat, Mocetinostat und Entinostat zeigte in Sarkomen antiproliferative und proapoptotische Effekte. Die Korrelation der HR23b Expression und der Sensitivität gegenüber HDACi zeigte weiterhin, dass HR23b ein potentieller neuer Biomarker für das Ansprechen von Vorinostat in Sarkomen darstellen könnte, da eine signifikante Korrelation beobachtet werden konnte. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die HR23b Expression konzentrationsabhängig unter HDACi reduziert wird. In einem Kollektiv aus über 500 klinischen Sarkom- und GIST-Proben konnte weiterhin gezeigt werden, dass 12,5% der Sarkome und 23,2% der GISTs stark positiv für HR23b sind. Vor allem stark aggressive Entitäten wie maligne periphere Nervenscheidewandtumore, Leiomyosarkome und Angiosarkome zeigten eine hohe HR23b Positivität, die sie zu potentiellen neuen Kandidaten für weitere Studien mit HDACi basierter Therapie machen. (Ihle et al., JCP, 2015).

Um diese Beobachtungen auf andere solide Tumore zu erweitern, soll die Expression und Funktion von HR23b auch in Melanomen und Adenokarzinomen der Lunge untersucht werden. Humane Zelllinien dieser Tumorentitäten werden in vitro auf ihre Sensitivität gegenüber HDACi in Korrelation mit der HR23b Expression untersucht. Weiterhin soll in allen untersuchten Tumorentitäten die Expression der einzelnen HDACs immunhistochemisch analysiert und diese mit der Sensitivität gegenüber HDACi korreliert werden.

Ein stabiler knock-down und eine stabile Überexpression der HR23b Expression mittels CRISPR/Cas soll Aufschluss über die zelluläre Funktion von HR23b geben. Hierbei wird vor allem die Sensitvität gegenüber HDACi, die Viabilität, die Apoptose und die Signaltransduktion untersucht. Murine mesenchymale Tumore sollen hergestellt werden, um die Funktion von HR23b auch in vivo analysieren zu können.

Das Team

Dr. rer. nat. Claudia Carl
Dr. rer. nat. Jana Fassunke
Dr. rer. med. Carina Heydt
Dr. rer. nat. Michaela A. Ihle
Svenja Wagener, M. Sc.

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